最近浙江大學(xué)婦產(chǎn)科醫(yī)院呂時銘、石一復(fù)等對妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤患者外周血腫瘤細(xì)胞檢測方法進(jìn)行研究，由于妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤起源于妊娠時胚外層的滋養(yǎng)細(xì)胞，具有增生活躍和易侵入母體血循環(huán)導(dǎo)致早期血行轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)。該腫瘤特征性分泌的hCG是理想的腫瘤標(biāo)志物，一直用于該腫瘤診斷、治療監(jiān)測與隨訪。近年來隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，在外周血中檢出腫瘤細(xì)胞的技術(shù)得以迅速發(fā)展，但用于檢測妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤尚未見報道。是否可以利用妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤細(xì)胞在分泌hCG時伴隨著細(xì)胞內(nèi)hCG-mRNA的表達(dá)的特點(diǎn)，以hCG-mRNA作為滋養(yǎng)細(xì)胞標(biāo)志，檢測進(jìn)入外周血中的滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤細(xì)胞，是一個值得研究的問題，這可能有益于腫瘤轉(zhuǎn)移的早期診斷。
1、循環(huán)血中β-hCG-mRNA檢出方法的建立 熒光定量PCR融匯了PCR和DNA探針雜交技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，采用熒光定量PCR技術(shù)原理為Taman技術(shù)，根據(jù)PCR反應(yīng)動力學(xué)特點(diǎn)，能獲得DNA模板的準(zhǔn)確定量結(jié)果。實(shí)驗(yàn)所用引物及熒光探針均采用美國PE公司DNA熒光定量分析專用軟件設(shè)計，β-hCG基因組序列參考有關(guān)文獻(xiàn)，對JAR細(xì)胞的β-hCG-mRNA先行逆轉(zhuǎn)錄，而后行熒光定量PCR分析，結(jié)果表明，使用本研究所設(shè)計的β-hCG-mRNA引物與熒光探針可以檢測到相當(dāng)于1個JAR細(xì)胞表達(dá)的β-hCG-mRNA量，且熒光增強(qiáng)隨著模板濃度增加而增加，從1個細(xì)胞的模板濃度到105細(xì)胞的模板濃度呈良好的線性關(guān)系，提示本研究所設(shè)計的β-hCG-mRNA引物與熒光探針以及所用的反應(yīng)程式可有效地用于β-hCG-mRNA的檢測，是檢測β-hCG-mRNA進(jìn)而推算hCG分泌細(xì)胞數(shù)量的有用方法，為研究妊娠期滋養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)入母體外周血的意義以及妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤患者外周血中的腫瘤細(xì)胞提供了方法學(xué)基礎(chǔ)。
2、妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤患者外周血中檢測腫瘤細(xì)胞的意義 妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病(腫瘤)是與妊娠相關(guān)的一組疾病，包括：葡萄胎、侵蝕性葡萄胎、絨毛膜癌和胎盤部位滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤。完全性葡萄胎和部分性葡萄胎的惡變率分別為20%和5%-8%，而幾乎所用的侵蝕性葡萄胎和約占50%絨毛膜癌來自于葡萄胎。因此，葡萄胎患者被要求隨訪。惡變者具有血行轉(zhuǎn)移之特點(diǎn)，循環(huán)血液中存在腫瘤細(xì)胞是血行轉(zhuǎn)移的基本條件之一，然而要檢出循環(huán)血液中存在腫瘤細(xì)胞較難。
呂時銘等將已知數(shù)量的JAR細(xì)胞摻入正常外周血中，然后測定其β-hCG-mRNA的量，推算混入血液中的細(xì)胞量，并以此作為外標(biāo)準(zhǔn)，通過測定妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤患者外周血中β-hCG-mRNA的量，推算患者外周血中相應(yīng)腫瘤細(xì)胞的量。結(jié)果顯示，盡管FQ-PCR法可以檢測到相當(dāng)于1個JAR細(xì)胞表達(dá)的mRNA量，但是當(dāng)JAR細(xì)胞摻入外周血后再分離，只有在每10ml中超過102時方能檢測到，此后隨摻入JAR細(xì)胞數(shù)量的增加，F(xiàn)Q-PCR所需的循環(huán)數(shù)減少，呈現(xiàn)較好的量效線性關(guān)系，與所測得的對等數(shù)量的未摻入外周血中的JAR細(xì)胞所表達(dá)的β-hCG-mRNA的量相近，提示本研究中采用的FQ-RT-PCR能很好地定量檢測hCG-mRNA，進(jìn)而推算hCG分泌細(xì)胞的數(shù)量，但從母血中富集細(xì)胞的方法尚需優(yōu)化。當(dāng)然，作為一種實(shí)驗(yàn)方法尚需經(jīng)特異性、靈敏度、抗干擾等多項(xiàng)評價，而本研究結(jié)果則為在外周血中利用細(xì)胞特異表達(dá)的hCG-mRNA檢出滋養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)探索。另一方面也為在其他腫瘤患者外周血中檢測腫瘤細(xì)胞提供了方法學(xué)的啟示。
本研究結(jié)果雖然只在9例中4例妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤患者額外周血中檢測到β-hCG-mRNA，推測這些病例外周血中存在有妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤細(xì)胞，雖然病例數(shù)所限無法從臨床分期等方面分析，但已能說明用本研究方法可能是檢測和證明妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤患者外周血中存在腫瘤細(xì)胞的有用手段。當(dāng)然其臨床應(yīng)用價值則需要病例的積累與動態(tài)觀察。以往對滋養(yǎng)細(xì)胞的診治研究的一個重要方面是有關(guān)腫瘤標(biāo)記物hCG的研究，hCG是其特異與敏感的腫瘤標(biāo)志物，這對于妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤的診斷與治療觀察與隨訪均有重要意義，但是外周血中測到hCG只能說明基因產(chǎn)物已分泌進(jìn)入血循環(huán)，只能反映體內(nèi)是否存在滋養(yǎng)細(xì)胞，以及滋養(yǎng)細(xì)胞量的多少，并不直接反映hCG分泌細(xì)胞(滋養(yǎng)細(xì)胞)是否已進(jìn)入血液循環(huán)，而外周血中β-hCG-mRNA的檢測有助于判斷是否有滋養(yǎng)細(xì)胞存在于外周血循環(huán)中，這對更加準(zhǔn)確的診斷和治療妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤是一有價值的貢獻(xiàn)。在妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤患者外周血中測到β-hCG-mRNA只提示有較多的腫瘤細(xì)胞進(jìn)入血循環(huán)，而這是否與患者的臨床分期和WHO預(yù)后評分有關(guān)，是否與腫瘤的轉(zhuǎn)移、預(yù)后有關(guān)，以及能否作為改變治療方案或進(jìn)一步治療的指示性標(biāo)志之一則需要多病例與長時間的病例跟蹤與預(yù)后調(diào)查，方可得出結(jié)論。鑒于妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤的轉(zhuǎn)移主要為血行轉(zhuǎn)移，因此對于外周血中β-hCG-mRNA陽性者可能應(yīng)較單純hCG陽性者給予更多的關(guān)注。
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